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qPCR plotの読み方
この記事で学ぶこと
- qPCR plotでCt値、しきい値、相対発現量を区別できる
- 内部標準遺伝子や基準条件を確認する理由を説明できる
- technical replicateとbiological replicateを分けて読める
qPCR（quantitative PCR）は、特定のDNAやRNA由来のcDNAを増幅しながら定量する方法です。論文では、増幅曲線、Ct値、相対発現量の棒グラフや点付きグラフとして示されます。
読むときは、どのサイクルで検出しきい値を超えたかと、どの基準で相対量に直しているかを確認します。見た目の差だけでなく、正規化や対照の取り方が解釈に関わります。
このFigureで何を見るか
Section titled “このFigureで何を見るか”このFigureでは、目的の遺伝子や配列が、条件間でどのくらい違って検出されたかを見ます。mRNA量の比較では、遺伝子発現とは何かやPCRとは何かの理解が土台になります。
図の構成要素
Section titled “図の構成要素”- 増幅曲線: PCRサイクルが進むにつれて蛍光シグナルが増える様子です。
- しきい値: シグナルを検出したと判断する基準線です。
- Ct値またはCq値: 曲線がしきい値を超えるサイクル数です。一般に、Ctが低いほど初期量が多いことを意味します。
- 内部標準遺伝子: サンプル量や反応効率の違いを補正するために使われます。
- 相対発現量: ΔΔCt法などで、基準条件に対する比として示されることがあります。
- エラーバーと点: 反復間のばらつきを示します。
- 何を測っているかを確認します。DNA量なのか、RNAをcDNAにして測った発現量なのかで意味が変わります。
- Ct値が低い条件と高い条件を確認します。
- 内部標準遺伝子や基準条件が何かを確認します。
- 相対発現量に変換されている場合、基準を1とした比較なのかを確認します。
- 反復数、エラーバー、点の散らばりを見ます。
- 統計検定がある場合、どの比較に対するp値かを確認します。
qPCR plotで迷ったら、Figureだけで判断せず、Methodsと統計の前提に戻ります。
- 実験の原理はqPCRとは何かとRT-qPCRとは何かで確認します。
- 棒グラフの高さやエラーバーは、平均と中央値とエラーバーに戻ると読みやすくなります。
nがtechnical replicateなのかbiological replicateなのかは、生物学的反復と技術的反復で確認します。- p値が付いている場合は、どの比較に対する検定かをFigure legendで確認します。
よくある誤解
Section titled “よくある誤解”- Ct値が高いほど発現量が高い、ではありません。Ct値が低いほど、しきい値に早く到達したことを示します。
- qPCRだけで遺伝子の働きが証明されるわけではありません。発現量の変化は、機能を考えるための手がかりです。
- 内部標準遺伝子が常に安定しているとは限りません。実験条件で変わらないかを確認する必要があります。
- 相対発現量のグラフでは、縦軸が線形か対数かで見え方が変わります。
関連する実験・解析
Section titled “関連する実験・解析”- RT-qPCRによるmRNA発現量の検証
- RNA-seqで見つかった候補遺伝子の確認
- 遺伝子ノックダウンや刺激実験後の発現変化の確認
- PCRとは何か
- RNA-seqとは何か
- 差次的発現解析とは何か
確認問題
読み終えた内容を、1問ずつ選択式で確認します。
未回答
4問
最高記録なし 復習なし